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技術(shù)百科

殼聚糖和聚乙烯亞胺及其衍生物作為基因載體的若干基本問(wèn)題的探討

2021-05-17 10:15:54    1239次瀏覽

近年來(lái),隨著(zhù)遺傳病和癌癥等疾病的發(fā)病率進(jìn)一步上升,陽(yáng)離子聚合物(polycation)等因可作為基因載體而用于基因治療,受到人們越來(lái)越多的關(guān)注。帶正電荷的陽(yáng)離子聚合物可以與帶負電荷的DNA相互作用并形成復合物(polyplex),適用于基因轉染。與病毒載體相比,雖然陽(yáng)離子聚合物介導的基因轉染效率較低,但具有易制備、易保存和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn),具有非常重要的研究意義和廣闊的應用前景。從來(lái)源上說(shuō),這些陽(yáng)離子聚合物主要包括兩大類(lèi),即合成高分子如聚乙烯亞胺(PEI)和天然高分子如殼聚糖(chitosan)。這些陽(yáng)離子聚合物大都有一定的轉染效率(以PEI為對照),然而,關(guān)于其具體的作用機理等一些基本問(wèn)題的研究尚存不足。本論文以這些常見(jiàn)的陽(yáng)離子聚合物及其衍生物為例,對若干現存問(wèn)題進(jìn)行了深入的探討,具體工作如下所述。1.以O-未甲基化N,N,N-三甲基殼聚糖(TMC)為研究對象,研究了陽(yáng)離子聚合物鏈長(cháng)度和轉染率的關(guān)系,并探討了影響這一結構/功能關(guān)系的因素。一般而言,鏈長(cháng)較長(cháng)的陽(yáng)離子聚合物介導了較高的轉染率,然而,對殼聚糖及其衍生物(如TMC),已有的文獻報道中并不符合這一規律。我們在合成了四種鏈長(cháng)度不同的O-未甲基化TMC的基礎上,對其結構進(jìn)行了明確的表征。由于在制備這些TMC的過(guò)程中基本不發(fā)生副反應,因此適合對其結構/功能關(guān)系的研究。通過(guò)熒光素酶(luciferase)在非洲綠猴腎細胞(COS-7),人胚腎細胞(293T)和人非小細胞肺癌細胞(NCI-H1299)中的表達以及綠色熒光蛋白(EGFP)在293T細胞中的表達,發(fā)現分子鏈越長(cháng)的TMC介導的轉染效率越高,即TMC也符合鏈長(cháng)較長(cháng)的陽(yáng)離子聚合物介導了較高的轉染率這一規律。究其原因,發(fā)現其主要的影響因素包括polyplex的穩定性、內吞方式和細胞內轉運途徑,而非陽(yáng)離子聚合物與pDNA的結合能力、polyplex的粒徑、zeta-電勢、血清、細胞毒性或內吞效率。值得注意的是,通常認為影響轉染效率的因素,如細胞毒性和內吞效率,并不影響這一結構/功能關(guān)系。因此,在制備陽(yáng)離子聚合物特別是殼聚糖基陽(yáng)離子聚合物作為基因載體時(shí),應特別注意polyplex的穩定性、內吞方式和細胞內轉運途徑。2.以PEI及其衍生物為研究對象,研究了它們在有血清和無(wú)血清測試條件下最優(yōu)氮磷比(N/P比,陽(yáng)離子聚合物中氮的摩爾含量與DNA中磷的摩爾含量之比;最優(yōu)N/P比即轉染效率最高時(shí)的N/P比)的變化,以及其他一些可能影響最優(yōu)N/P比的因素。在己有的報道中,陽(yáng)離子聚合物的轉染效率大都在不同條件下采用特定的N/P比(或質(zhì)量比)進(jìn)行檢測。但實(shí)際上,隨著(zhù)條件的不同,其最優(yōu)N/P比(陽(yáng)離子聚合物介導的基因載體的轉染效率達到最高時(shí)的N/P比)也會(huì )不同。因此,若采用若干特定的N/P比進(jìn)行研究,結論可能不甚合理。本文就這一問(wèn)題通過(guò)PEI及其衍生物進(jìn)行了深入探索。研究中所合成的PEI的衍生物包括甲基化PEI、季胺化PEI、乙?;疨EI、丙氨酸改性的PEI、賴(lài)氨酸改性的PEI、PEG化的PEI、胍化的PEI及咪唑基團改性的PEI等,通過(guò)NMR和元素分析等對這些PEI的衍生物進(jìn)行明確的表征。在COS-7細胞中的轉染實(shí)驗結果表明,PEI及其衍生物的最優(yōu)N/P比各自不同,例如未改性的PEI的最優(yōu)N/P比在6-10,而丙氨酸改性的PEI的最優(yōu)N/P比在40-80,PEG化的PEI的最優(yōu)N/P比不小于100。另一方面,與無(wú)血清存在的條件下相比,有血清時(shí)這些最優(yōu)N/P比將顯著(zhù)變大,例如在10%血清條件下,未改性的PEI的最優(yōu)N/P比在20-30,丙氨酸修飾的PEI的最優(yōu)N/P比不小于100,PEG化的PEI的最優(yōu)N/P比不小于250,等等。同時(shí),通過(guò)研究相應的測試條件對PEI轉染率的影響,發(fā)現polyplex的制備條件、復合物的劑量、培養基的添加物及細胞系的種類(lèi)同樣會(huì )影響其轉染率和最優(yōu)N/P比。因此,我們認為,在測定陽(yáng)離子聚合物作為基因載體的轉染效率時(shí),應充分認識到測試條件與最終結果之間的關(guān)系。特別是將PEI用作對照時(shí),需證明并采用PEI的最優(yōu)條件。3.以TMC/pDNA polyplex (TMC-P)和PEI自由鏈(PEI-F)為研究對象,探討了陽(yáng)離子聚合物自由鏈在其介導的基因轉染中的作用。一般而言,在N/P比較低時(shí),陽(yáng)離子聚合物便能和pDNA形成較穩定的polyplex;而較高的轉染效率只有在N/P比較高時(shí)才能達到。因此,有一部分陽(yáng)離子聚合物自由鏈對有效的基因轉染起到了非常重要的作用。由于PEI-P在細胞培養基中不穩定,當探索陽(yáng)離子聚合物自由鏈所扮演的角色時(shí),以PEI-P/PEI-F為研究對象并不能很好地排除二者的相互作用。但是,TMC-P/PEI-F的研究體系在DMEM中卻非常穩定,且采用不同種類(lèi)的polyplex和自由鏈,能夠更好地研究自由鏈的功能。通過(guò)TMC-P/PEI-F介導的熒光素酶的表達,我們發(fā)現PEI-F能有效提高TMC-P的轉染效率。通過(guò)在含有細胞內吞通路抑制劑情況下的基因表達,我們發(fā)現網(wǎng)格蛋白抑制劑對PEI-P/PEI-F有明顯的抑制效果,對TMC-P/TMC-F無(wú)抑制效果,然而對TMC-P/PEI-F則有一定的抑制效果;此外,質(zhì)子泵抑制劑對TMC-P/PEI-F的抑制效果也介于PEI-P/PEI-F和TMC-P/TMC-F之間??梢?jiàn)自由鏈能明顯影響polyplex的內吞方式和細胞內轉運途徑。此外,這些陽(yáng)離子自由鏈本身作為高分子治療(polymer therapy)的一種方式值得進(jìn)一步深入研究。事實(shí)上,陽(yáng)離子聚合物介導的基因轉染是一個(gè)極為復雜的過(guò)程。從聚合物結構的設計,到polyplex的制備和運輸,再到與靶細胞的識別和內吞,乃至細胞內的轉運,最終到達細胞內靶位并產(chǎn)生作用,整個(gè)過(guò)程都需要精心的構思與細致的設計,但這些均建立在對基因轉染整個(gè)過(guò)程深入了解的基礎之上。因此,本論文不僅就陽(yáng)離子聚合物作為基因載體的若干基本問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究和探索,其結果也為合理設計及表征用于基因載體的新型陽(yáng)離子聚合物提供了理論基礎和實(shí)驗依據。

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