聚乙烯亞胺/多巴胺改性氧化硅固定碳酸酐酶

摘 要

利用聚乙烯亞胺（PEI）/多巴胺（DA）共沉積法改性氧化硅，并以此為載體固定化碳酸酐酶（CA）?？疾炝薖EI/DA質(zhì)量比、沉積時(shí)間對沉積率的影響，用傅里葉紅外光譜（FTIR）和掃描電子顯微鏡（SEM）對改性前后的微球進(jìn)行了表征；研究了沉積率、載體用量、酶濃度及戊二醛（GA）濃度對固定化酶活回收率的影響；考察了固定化酶的儲存穩定性和重復利用性。結果表明，隨PEI/DA質(zhì)量比增加，沉積率先增加后降低，質(zhì)量比為1∶1時(shí)最大；隨沉積時(shí)間增加，沉積率線(xiàn)性增長(cháng)，10 h后PEI/DA體系沉積率為單獨DA沉積改性的2.66倍，但沉積時(shí)間對N元素含量和酶活回收率影響不大；酶固定化時(shí)載體用量存在飽和值，CA和GA濃度的最優(yōu)值分別為0.8 mg/ml和0.1%(質(zhì)量)，此時(shí)酶活回收率可達78.8%。在25℃下儲存30 d后，固定化酶的保留活性為77.2%，而游離酶只有12%；重復使用10次后，固定化酶仍能保持88.3%的相對活性。

引 言

近年來(lái)，利用生物酶法捕集CO2受到了越來(lái)越多的重視，碳酸酐酶（CA）快速有效地催化CO2的可逆水合反應，且反應條件溫和、高效專(zhuān)一、污染少和后處理簡(jiǎn)單，是一種綠色工藝。然而，CA價(jià)格高、穩定性差且不易重復利用，需要對其進(jìn)行固定化。

常用的載體材料可分為高分子材料、無(wú)機材料、聚合物-無(wú)機復合材料等。無(wú)機材料具有穩定性好、機械強度高、耐酸堿、造價(jià)低廉和使用壽命長(cháng)等優(yōu)點(diǎn)，應用廣泛。常用的有介孔分子篩、多孔玻璃（CPG）、磁性納米顆粒、二氧化硅（SiO2）等。為了與酶分子形成共價(jià)連接，固定化之前通常需用硅烷偶聯(lián)劑對載體表面功能化，引入活性基團。例如，Fei等分別以3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）和3-縮水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）改性得到氨基和環(huán)氧基功能化的介孔分子篩，前者通過(guò)戊二醛（GA）將CA交聯(lián)到載體表面，后者直接與CA反應，制備了兩種固定化CA，對熱、酸堿的穩定性和儲存穩定性都得到了很大提高，并具有良好的重復利用性。張朝暉等先利用APTES對CPG表面硅烷化處理，再用GA將其活化后固定化CA，固定化酶的最大活力為1.32 U/g CPG，固定化效率為33.4%。Al-Dhrub等先用SiO2包覆磁性納米顆粒，再用APTES在SiO2表面引入氨基，然后通過(guò)GA固定化CA，酶的穩定性提高。綜上所述，固定化后CA的穩定性及重復利用性通?？傻玫矫黠@改善，但固定化效率以及酶活較低。這是因為采用硅烷偶聯(lián)劑改性時(shí)，對載體表面的羥基數量和活性要求較高，存在一定的局限性；而且濕法改性過(guò)程比較煩瑣，常涉及甲苯等有機溶劑。因此，迫切需要尋找一種簡(jiǎn)單、便捷、適用性更廣的表面改性及固定化CA方法。

近年來(lái)，以多巴胺（DA）為代表的貽貝仿生沉積技術(shù)引起了研究者的廣泛關(guān)注。在有氧和弱堿性條件下，DA可自發(fā)地在材料表面氧化自聚形成聚多巴胺（PDA）涂層。操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行、條件可控，適用于各種類(lèi)型和形狀的材料，且成本低廉、易于大規模操作。然而，單純DA的自聚所需時(shí)間較長(cháng)，形成的涂層不均勻、穩定性差，通過(guò)添加含有伯胺的聚合物如聚丙烯酰胺（PAM）、聚乙烯亞胺（PEI）等可以促進(jìn)DA的均相聚合和沉積，大大縮短沉積時(shí)間并進(jìn)一步改善表面親水性。這種方法已用于漆酶在納濾膜上的固定化，在酶負載量、活性以及固定化酶的穩定性方面均表現出更好的性能。尚未見(jiàn)到用于CA的報道。

本文將以SiO2微球為載體，采用PEI/DA共沉積法引入氨基，然后用GA固定化CA。研究載體改性條件包括PEI和DA的質(zhì)量比、沉積時(shí)間對沉積率的影響，并對改性前后的微球進(jìn)行表征；優(yōu)化酶固定化條件，考察其儲存穩定性和重復利用性。

結 論

（1）通過(guò)聚乙烯亞胺/多巴胺共沉積法改性得到PEI/PDA-SiO2，FTIR和SEM結果以及實(shí)驗現象都表明PEI/PDA沉積到SiO2微球表面。

（2）PEI/DA質(zhì)量比和沉積時(shí)間對沉積率影響較大，質(zhì)量比過(guò)低和過(guò)高都會(huì )造成沉積率下降；隨沉積時(shí)間延長(cháng)，沉積率呈線(xiàn)性增長(cháng)，PEI/DA體系的沉積率高于DA單獨沉積的體系。

（3）沉積率對載體表面N 元素含量和固定化酶活回收率影響不大；制備的PEI/PDA-SiO2用于固定化CA時(shí)，載體用量、酶濃度和GA濃度都對固定化酶活回收率有影響，需要仔細調控。

（4）固定化后的CA具有較高的酶活回收率（接近80%），貯存穩定性大大提高，并且具有良好的重復利用性。

1 實(shí)驗材料和方法

1.1

材料

1.2

1.3

PEI/DA共沉積改性SiO2微球的制備

1.4

固定化CA及表征

圖1 PEI/DA共沉積改性微球及固定化CA示意圖

2 實(shí)驗結果與討論

2.1

SiO2微球表面改性及表征

圖2 PEI/DA質(zhì)量比對沉積率的影響

圖3 沉積時(shí)間對沉積率的影響

圖4 SiO2微球改性前后的FTIR譜圖

2.2

CA固定化及表征

圖5 沉積率對N元素含量和固定化酶活回收率的影響

圖6 PEI/PDA-SiO2用量對固定化酶活回收率的影響

圖7 CA濃度對固定化酶活回收率的影響

圖8 GA濃度對固定化酶活回收率的影響

圖9 固定化酶和游離酶在25℃的儲存穩定性